书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ５６ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５６ — ２００１ 实验动物 　 狂犬病病毒检测方法 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾 — 犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犚犪犫犻犲狊狏犻狉狌狊 ２００８  １２  １０ 发布 ２００９  ０３  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 《 实验动物 》 共 ５４ 个部分 ， 为不同微生物和病毒检测技术方法 。 本部分自实施之日起代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５６ — ２００１ 《 实验动物 　 狂犬病病毒检测方法 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５６ — ２００１ 相比主要技术差异如下 ： ａ ） 　 删除原标准中 “ ２ 　 引用标准 ” 内容 ； ｂ ） 　 对原标准中 “ ３ 　 原理 ” 中所有内容改为 “ 在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原 ， 使免疫反应在 固相载体上进行 。 当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时 ， 则与孔壁上的抗原形成抗原  抗体 复合物 ， 再与抗犬 ＩｇＧ 酶标记物反应 ， 最后通过测定酶作用底物催化后的产物 ， 进行定性 检测 ”； ｃ ） 　 删除原标准中所有关于血凝抑制试验的试剂 、 方法及结果判定 ； ｄ ） 　 对原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容进行修改 ， 包括试剂 、 方法及结果判定等 ； ｅ ） 　 对原标准中 “ ６ 　 结果判定 ” 中增加了 “ ６．３ 　 基础级犬群体免疫抗体合格率 ： 免疫抗体合格率 ＝ （ 被检动物抗体阳性数 ／ 被检动物总数 ） ×１００％ 。 基础级犬群体免疫抗体合格率达到 ７０％ 以 上可判为该犬群免疫合格 ” 内容 。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口 。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草 。 本部分主要起草人 ： 田克恭 、 陈西钊 、 曹振 、 王传彬 、 何秀敏 、 汤汉文 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５６ — ２００１ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ５６ — ２００８ 实验动物 　 狂犬病病毒检测方法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 的本部分规定了狂犬病病毒 （ ＲＶ ） 的检测方法 、 试剂等 。 本部分适用于犬 ＲＶ 的检测 。 ２ 　 原理 在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原 ， 使免疫反应在固相载体上进行 。 当被检血清中有狂犬病病 毒抗体存在时 ， 则与孔壁上的抗原形成抗原  抗体复合物 ， 再与抗犬 ＩｇＧ 酶标记物反应 ， 最后通过测定酶 作用底物催化后的产物 ， 进行定性检测 。 ３ 　 主要试剂和器材 ３ ． １ 　 试剂 犬狂犬病毒 ＩｇＧ 抗体检测试剂盒 （ 定性 ）， 包括 ： ａ ） 　 预包被狂犬病毒抗原的微孔板 ； ｂ ） 　 狂犬病毒 ＩｇＧ 酶标记物 ； ｃ ） 　 狂犬病毒 ＩｇＧ 阳性对照 ； ｄ ） 　 狂犬病毒 ＩｇＧ 临界对照 ； ｅ ） 　 狂犬病毒 ＩｇＧ 阴性对照 ； ｆ ） 　 显色液 Ａ ： 磷酸氢 ＝ 钠  柠檬酸缓冲液 （ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ５．０ ） １０００ｍＬ ， ３０％ 过氧化氢 Ｈ ２ Ｏ ２ （ ＭＷ３４．０ ） ３．５ｍＬ ； ｇ ） 　 显色液 Ｂ ： 柠檬酸 １．０５２ｇ ， 乙二胺四乙酸二钠 （ ＥＤＴＡＮａ ２ ） ０．１８６ｇ ， 四甲基联苯胺 （ ＴＭＢ ） ０．２５ｇ ， 二甲基亚砜 （ ＤＭＳＯ ） ８．０ｍＬ ， 纯化水 ９９２ｍＬ ； ｈ ） 　 终止液 ： ９８％ 硫酸 ２７．８ｍＬ ， 纯化水 ９７２．２ｍＬ ； ｉ ） 　 １０ 倍浓缩洗涤液 ： ＰＢＳ （ ０．１ｍｏｌ ／ ＬｐＨ７．２ ～ ７．４ ） ９９５ｍＬ ， 吐温 ２０ ， ５ｍＬ ； ｊ ） 　 样品稀释液 ： 硼酸盐缓冲液 （ ０．０１ｍｏｌ ／ ＬｐＨ８．０ ） ９５６．０ｍＬ ， 甘油 （ ＭＷ９２．０９ ） ４０．０ｍＬ ， 酪蛋白 （ ｃａｓｅｉｎ ） １０％ 硫柳汞钠溶液 ２．０ｍＬ ， 吐温 ２０ ， １．０ｍＬ１％ 酚红溶液 ， １．０ｍＬ 。 试剂在使用前应恢复至室温 （ １８℃ ～ ２５℃ ）。 ３ ． ２ 　 器材 器材包括 ： ａ ） 　 精密移液器 １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ ； ｂ ） 　 一次性移液器吸头 ； ｃ ） 　 振荡器 ； ｄ ） 　 酶标仪 （ 含 ４５０ｎｍ 波长滤光片 ）； ｅ ） 　 ３７℃ 恒温培养箱 ； ｆ ） 　 蒸馏水或去离子水 ； ｇ ） 　 １００ｍＬ 量筒 ； ｈ ） 　 离心机 ； ｉ ） 　 吸水纸 。 １ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ５６ — ２００８ ４ 　 检测方法 ４ ． １ 　 样品的准备 将采集到的待检犬血液样品离心 ， 分离出待检犬血清或血浆 。 应避免使用染菌 、 溶血和高血脂的样 品 ； 室温保存样品不应超过 ８ｈ ， 若试验在 ８ｈ 以后进行 ， 需将样品保存在 ２℃ ～ １０℃ ， 如保存超过 １ 周 ， 则应保存在 －２０℃ 并避免反复冻融 。 ４ ． ２ 　 试剂配置 将 １０ 倍浓缩洗涤液恢复至室温 ， 并振摇 ， 然后用去离子水或蒸馏水作 １０ 倍稀释 。 ４ ． ３ 　 稀释样品 将已分离好的犬血清或血浆用样品稀释液做 １∶１０ 稀释 ， 即取 ５０ μ Ｌ 血清或血浆加入到 ５００ μ Ｌ 样 品稀释液中 ， 并充分混匀 。 ４ ． ４ 　 加样 取所需量的预包被微孔板条固定于板架上 ， 依次加入稀释好的样品 ， １００ μ Ｌ ／ 孔 ， 然后将阳性 、 阴性 对照各加 １ 孔 ， 临界对照加 ３ 孔 ， １００ μ Ｌ ／ 孔 ， 另留一孔不加样品作为空白对照 ， 在记录纸上记录各样品 和对照的次序或位置 ， 剩余的板条放入密封袋中保存 。 ４ ． ５ 　 孵育 加样完成后 ， 用封板膜覆盖板条 ， 置 ３７℃ 恒温培养箱中孵育 ３０ｍｉｎ 。 ４ ． ６ 　 洗板 甩净孔中液体 ， 拍干 ， 用稀释好的洗涤液加满每孔 ， 停留 １ｍｉｎ 后甩净 、 拍干 ， 如此重复洗涤 ３ 次 。 ４ ． ７ 　 加酶 除空白对照外 ， 其余各孔垂直滴加酶标记物 １ 滴 （ ５０ μ Ｌ ）， 置 ３７℃ 恒温培养箱孵育 ３０ｍｉｎ 。 ４ ． ８ 　 显色 重复步骤 ４．６ 洗板 ３ 次 ， 拍干后每孔 （ 含空白对照孔 ） 垂直滴加显色液 Ａ 、 Ｂ 液各 １ 滴 ， 置 ３７℃ 恒温 培养箱避光显色 １０ｍｉｎ 。 ４ ． ９ 　 终止 每孔 （ 含空白对照孔 ） 立即加入终止液 １ 滴 ， 混匀后以空白孔调零 ， 用酶标仪 ４５０ｎｍ 波长测定 Ａ 值 。 ５ 　 结果判定 ５ ． １ 　 试验结果符合下列条件 ， 方为有效 ： 以空白孔调零 ， 阴性对照值小于等于 ０．１０ ， 临界对照 Ａ 值应在 ０．１５ ～ ０．４０ 之间 ， 证明试验成立 。 ５ ． ２ 　 结果判定 ５ ． ２ ． １ 　 待检样品 Ａ 值大于等于临界对照 Ａ 值的平均值 ， 判为阳性 ； ５ ． ２ ． ２ 　 待检样品 Ａ 值小于临界对照 Ａ 值的平均值 ， 判为阴性 。 ６ 　 结果解释 ６ ． １ 　 基础级犬 ： 接种疫苗后 ， 经 ＥＬＩＳＡ 检测抗体效价达到阳性值判为合格 。 ６ ． ２ 　 ＳＰＦ 级犬 ， 不应进行疫苗接种 ， 对阳性检测结果 ， 选用同一种方法或另一种方法重试 。 如为阳性 则判为阳性 。 ６ ． ３ 　 基础级犬群体免疫抗体合格率 ： 免疫抗体合格率 ＝ （ 被检动物抗体阳性数 ／ 被检动物总数 ） ×１００％ 基础级犬群体免疫抗体合格率达到 ７０％ 以上可判为该犬群免疫合格 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ５６ — ２００８ ７ 　 结果报告 根据判定结果 ， 作出报告 。 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ５６ — ２００８ 书 书 书 ８００２ — ６５  ６２９４１ 犜 ／ 犅犌 中华人民共和国 国家标准 实验动物 　 狂犬病病毒检测方法 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５６ — ２００８  中国标准出版社出版发行 北京复兴门外三里河北街 １６ 号 邮政编码 ： １０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话 ： ６８５２３９４６ 　 ６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销  开本 ８８０×１２３０１ ／ １６ 　 印张 ０．５ 　 字数 ７ 千字 ２００９ 年 ２ 月第一版 　 ２００９ 年 ２ 月第一次印刷  书号 ： １５５０６６ · １３５７６８ 如有印装差错 　 由本社发行中心调换 版权专有 　 侵权必究 举报电话 ：（ ０１０ ） ６８５３３５３３