书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ２１ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．２１ — ２００１ 实验动物 　 兔出血症病毒检测方法 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾 — 犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犚犪犫犫犻狋 犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊 （ 犚犎犇犞 ） ２００８  １２  １０ 发布 ２００９  ０３  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书中华人民共和国 国家标准 实验动物 　 兔出血症病毒检测方法 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．２１ — ２００８  中国标准出版社出版发行 北京复兴门外三里河北街 １６ 号 邮政编码 ： １０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话 ： ６８５２３９４６ 　 ６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 各地新华书店经销  开本 ８８０×１２３０１ ／ １６ 　 印张 ０．５ 　 字数 ９ 千字 ２００９ 年 ２ 月第一版 　 ２００９ 年 ２ 月第一次印刷  书号 ： １５５０６６ · １３５７６６ 如有印装差错 　 由本社发行中心调换 版权专有 　 侵权必究 举报电话 ：（ ０１０ ） ６８５３３５３３ 书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 《 实验动物 》 共 ５４ 个部分 ， 为不同微生物和病毒检测技术方法 。 本部分自实施之日起代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．２１ — ２００１ 《 实验动物 　 兔出血症病毒检测方法 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．２１ — ２００１ 相比主要技术差异如下 ： ａ ） 　 增加兔出血症病毒核酸 （ ＲＨＤＶ ） 核酸检测方法 ； ｂ ） 　 确定兔免疫接种 ＲＨＤＶ 疫苗后的血清抗体合格判定标准 。 本部分由全国实验动物标准化委员会提出并归口 。 本部分起草单位 ： 全国实验动物标准化技术委员会 。 本部分主要起草人 ： 贺争鸣 、 付瑞 、 田克恭 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．２１ — １９９４ ， ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．２１ — ２００１ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ２１ — ２００８ 实验动物 　 兔出血症病毒检测方法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 的本部分规定了兔出血症病毒 （ ＲＨＤＶ ） 的检测方法 。 本部分适用于兔 ＲＨＤＶ 抗原 、 抗体和病毒核酸的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６ 的本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文 件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本 部分 。 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５３ 　 实验动物 　 血凝试验 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５４ 　 实验动物 　 血凝抑制试验 ３ 　 原理 血凝试验 （ ＨＡ ）： 在一定条件下 ， ＲＨＤＶ 能凝集人 “ Ｏ ” 型红细胞 ， 产生可见的凝集反应 。 根据这一 特性检测兔肝组织中有无 ＲＨＤＶ 抗原 。 血凝抑制试验 （ ＨＡＩ ）： 在一定条件下 ， ＲＨＤＶ 凝集人 “ Ｏ ” 型红细胞的能力可被特异性抗体所抑制 。 根据这一特性检测兔血清中有无 ＲＨＤＶ 抗体 。 核酸检测 ： 根据 ＲＨＤＶＶＰ６０ 基因序列保守的特点 ， 设计特异引物 ， 扩增目的片段 ， 检测兔组织中 的 ＲＨＤＶ 核酸 。 ４ 　 主要试剂与器材 ４ ． １ 　 试剂 ４ ． １ ． １ 　 血凝素 人工感染或自然发病的兔肝组织 ， 经研磨制成 １０％ 悬液 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 而获得的上 清液 。 ４ ． １ ． ２ 　 阳性血清 ＲＨＤＶ 抗原免疫或 ＲＨＤＶ 自然感染恢复后的兔血清 。 ４ ． １ ． ３ 　 阴性血清 无 ＲＨＤＶ 感染 、 未经免疫的兔血清 。 ４ ． １ ． ４ 　 人 “ Ｏ ” 型红细胞 。 ４ ． １ ． ５ 　 缓冲液与溶液 ４ ． １ ． ５ ． １ 　 ＰＢＳ （ ｐＨ７．４ ） ＮａＣｌ 　　　　　　　　 ８ｇ ＫＣｌ ０．２ｇ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ２．８３ｇ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ０．２ｇ 去离子水 １０００ｍＬ ４ ． １ ． ５ ． ２ 　 ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ 。 １ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ２１ — ２００８ ４ ． １ ． ５ ． ３ 　 ５０×ＴＡＥＢｕｆｆｅｒ （ ｐＨ８．５ ） Ｔｒｉｓ ２４２ｇ 醋酸 ５７．１ｍＬ Ｎａ ２ ＥＤＴＡ · ２Ｈ ２ Ｏ３７．２ｇ 去离子水 １０００ｍＬ ４ ． １ ． ５ ． ４ 　 溴乙锭 （ １０ｍｇ ／ ｍＬ ）。 ４ ． １ ． ５ ． ５ 　 ６×ＬｏｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ 。 ４ ． １ ． ５ ． ６ 　 氨苄青霉素 （ １００ｍｇ ／ ｍＬ ）。 ４ ． １ ． ５ ． ７ 　 三氯甲烷 （ 分析纯 ）。 ４ ． １ ． ５ ． ８ 　 乙醇 （ 分析纯 ）。 ４ ． １ ． ５ ． ９ 　 异丙醇 （ 分析纯 ）。 ４ ． １ ． ６ 　 酶与缓冲液 ４ ． １ ． ６ ． １ 　 ５×ＡＭＶＲＴＢｕｆｆｅｒ ， ＡＭＶＲＴａｓｅ （ １０Ｕ ／ μ Ｌ ）。 ４ ． １ ． ６ ． ２ 　 ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ ４０Ｕ ／ μ Ｌ ）。 ４ ． １ ． ６ ． ３ 　 ＤＥＰＣＨ ２ Ｏ 。 ４ ． １ ． ６ ． ４ 　 随机引物 ９ｍｅｒｓ （ ５００ μ ｇ ／ ｍＬ ）。 ４ ． １ ． ６ ． ５ 　 ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ （ ２．５ｍｍｏｌ ／ Ｌｅａｃｈ ）。 ４ ． １ ． ６ ． ６ 　 ＭｇＣｌ ２ （ ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）， １０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ ， 犜犪狇 ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ ５Ｕ ／ μ Ｌ ）。 ４ ． １ ． ７ 　 培养基 ４ ． １ ． ７ ． １ 　 ＬＢ 培养基 ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ ＮａＣｌ １０ｇ 去离子水 １０００ｍＬ ４ ． １ ． ７ ． ２ 　 ＬＢ ／ Ａｍｐ ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ ＮａＣｌ １０ｇ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ １００ μ ｇ ／ ｍＬ 去离子水 １０００ｍＬ ４ ． １ ． ８ 　 琼脂糖凝胶 ＡｇａｒｏｓｅＬ０３ 。 ４ ． １ ． ９ 　 感受态细胞与载体 ４ ． １ ． ９ ． １ 　 适用于所构建克隆载体的大肠杆菌感受态细胞 。 ４ ． １ ． ９ ． ２ 　 ＤＮＡ 片段琼脂糖凝胶纯化试剂盒 。 ４ ． １ ． ９ ． ３ 　 可用于连接 ＰＣＲ 产物的商品化 Ｔ 载体 。 ４ ． １ ． ９ ． ４ 　 质粒小量提取试剂盒 。 ４ ． ２ 　 器材 ４ ． ２ ． １ 　 微量振荡器 。 ４ ． ２ ． ２ 　 微量血凝反应板 （ Ｕ 型或 Ｖ 型 ）。 ４ ． ２ ． ３ 　 微量加样器 （ 容量 ０．５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ ， ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ）。 ４ ． ２ ． ４ 　 生物安全柜 。 ４ ． ２ ． ５ 　 冷冻离心机 。 ４ ． ２ ． ６ 　 紫外分光光度仪 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １４９２６ ． ２１ — ２００８ ４ ． ２ ． ７ 　 ＰＣＲ 仪 。 ４ ． ２ ． ８ 　 电泳仪 。 ４ ． ２ ． ９ 　 紫外透射仪 。 ４ ． ２ ． １０ 　 恒温培养箱 。 ４ ． ２ ． １１ 　 恒温摇床 。 ４ ． ２ ． １２ 　 恒温水浴箱 。 ４ ． ２ ． １３ 　 超纯水系统 。 ４ ． ２ ． １４ 　 冰箱 。 ５ 　 操作步骤 ５ ． １ 　 采用 ＨＡ 方法 （ 见 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５３ ） 进行病毒抗原检测 。 ５ ． ２ 　 采用 ＨＡＩ 方法 （ 见 ＧＢ ／ Ｔ１４９２６．５４ ） 进行病毒抗体检测 。 ５ ． ３ 　 病毒核酸检测 ５ ． ３ ． １ 　 引物设计 根据 ＲＨＤＶＦＤＲ 株序列 （ ＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ： ＮＣ ＿ ００１５４３ ）， 针对 ＶＰ６０ 基因区段设计引物 。 引物在 ＲＨＤＶ 基因组中的位置 、 核苷酸组成及预期扩增目的基因长度见表 １ 。 表 １ 　 犚犜犘犆犚 引物 引物 位置 序列 产物大小 正向引物 Ｐ１ ｎｔ６２５４ｎｔ６２７１５ ’ ＡＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧ３ ’ ３６８ｂ ｐ 反向引物 Ｐ２ ｎｔ６６２１ｎｔ６６０２５ ’ ＴＴＧＡＧＧＣＧＴＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧ３ ’ — ５ ． ３ ． ２ 　 ＲＮＡ 提取 ５ ． ３ ． ２ ． １ 　 在生物安全柜内 ， 取 ＲＨＤＶ 感染的兔肝组织 ５０ｍｇ ～ １００ｍｇ ， 置于灭菌玻璃研磨器中 ， 加 １ｍＬ 灭菌 ＰＢＳ （ ｐＨ７．４ ） 充分研磨 。 ５ ． ３ ． ２ ． ２ 　 将肝组织匀浆转移至 １．５ｍＬ 洁净离心管中 ， 加入 １ｍＬＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ ， 混匀 ， 室温放置 １０ｍｉｎ 。 ５ ． ３ ． ２ ． ３ 　 加 ０．２ｍＬ 三氯甲烷