书 书 书犐犆犛 ７１ ． ０４０ ． ４０ 犌 ７６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １４６４３ ． ３ — ２００９ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３．３ — １９９３ 工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第 ３ 部分 ： 黏泥真菌的测定 平皿计数法 犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犫犪犮狋犲狉犻犪犪狀犱犪犾犵犪犲犻狀犻狀犱狌狊狋狉犻犪犾犮犻狉犮狌犾犪狋犻狀犵犮狅狅犾犻狀犵狑犪狋犲狉 — 犘犪狉狋 ３ ： 犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊犾犻犿犲犳狅狉犿犲犱犳狌狀犵犻 — 犛狋犪狀犱犪狉犱狅犳狆犾犪狋犲犮狅狌狀狋 ２００９  ０５  １８ 发布 ２０１０  ０２  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３ 《 工业循环冷却水中菌藻的测定方法 》 分为以下几个部分 ： ——— 第 １ 部分 ： 黏液形成菌的测定 　 平皿计数法 ——— 第 ２ 部分 ： 土壤菌群的测定 　 平皿计数法 ——— 第 ３ 部分 ： 黏泥真菌的测定 　 平皿计数法 ——— 第 ４ 部分 ： 土壤真菌的测定 　 平皿计数法 ——— 第 ５ 部分 ： 硫酸盐还原菌的测定 　 ＭＰＮ 法 ——— 第 ６ 部分 ： 铁细菌的测定 　 ＭＰＮ 法 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３ 的第 ３ 部分 。 本部分代替 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３．３ — １９９３ 《 工业循环冷却水中黏泥真菌的测定 　 平皿计数法 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３．３ — １９９３ 相比 ， 在技术内容上并无变化 ， 只是对文本结构和文字进行了修改 。 本部分由中国石油和化学工业协会提出 。 本部分由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ６３ ／ ＳＣ５ ） 归口 。 本部分负责起草单位 ： 中海油天津化工研究设计院 、 上海未来企业有限公司 。 本部分主要起草人 ： 邵宏谦 、 刘昕 、 张全 、 李琳 、 朱传俊 。 本部分于 １９９３ 年首次发布 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １４６４３ ． ３ — ２００９ 工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第 ３ 部分 ： 黏泥真菌的测定 平皿计数法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３ 的本部分规定了工业循环冷却水中黏泥真菌的测定方法 。 本部分适用于工业循环冷却水中黏泥真菌的测定 ， 也适用于原水 、 生活用水及其他水中黏泥真菌的 测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 ＧＢ ／ Ｔ１４６４３ 的本部分的引用而成为本部分的条款 。 凡是注日期的引用文 件 ， 其随后所有的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本部分 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本 部分 。 ＧＢ ／ Ｔ６０３ 　 化学试剂 　 试验方法中所用制剂及制品的制备 （ ＧＢ ／ Ｔ６０３ — ２００２ ， ＩＳＯ６３５３１ ： １９８２ ， ＮＥＱ ） ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ３ 　 方法提要 本方法采用 ２５ 号浮游生物网收集循环冷却水中的黏泥 ， 所得的黏泥用石英砂充分研磨使细胞分 散 ， 再利用平皿计数技术在 （ ２９±１ ） ℃ 培养 ７２ｈ 来测定黏泥中真菌总数 。 ４ 　 试剂和材料 本部分所用试剂 ， 除非另有规定 ， 应使用分析纯试剂和符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 三级水的规定 。 试验中所需制剂及制品 ， 在没有注明其他要求时 ， 均按 ＧＢ ／ Ｔ６０３ 之规定制备 。 ４ ． １ 　 马铃薯 ： 市售新鲜 （ 无芽 ）， 去皮后切成约 ２０ｍｍ×２０ｍｍ×２０ｍｍ 小块 。 ４ ． ２ 　 葡萄糖 。 ４ ． ３ 　 琼脂 ： 生物试剂 。 ４ ． ４ 　 石英砂 ： ２１０ μ ｍ ～ １５０ μ ｍ （ ７０ 目 ～ １００ 目 ）。 ４ ． ５ 　 氯化钠 。 ４ ． ６ 　 乳酸 。 ４ ． ７ 　 乙醇溶液 ： ７５％ （ 体积分数 ）。 ４ ． ８ 　 牛皮纸 。 ４ ． ９ 　 医用脱脂棉 。 ４ ． １０ 　 医用脱脂纱布 。 ５ 　 仪器 、 设备 ５ ． １ 　 无菌箱 （ 室 ） 或超净工作台 。 ５ ． ２ 　 蒸汽压力灭菌器 。 １ 犌犅 ／ 犜 １４６４３ ． ３ — ２００９ ５ ． ３ 　 生化培养箱 。 ５ ． ４ 　 鼓风电热干燥箱 ： 温度可控制在 ６０℃ ～ ２８０℃ 。 ５ ． ５ 　 铝锅 ：  ２００ｍｍ 。 ５ ． ６ 　 ２５ 号浮游生物网 。 ５ ． ７ 　 转子流量计 （ ０ ～ ２ｍ ３ ／ ｈ ）。 ５ ． ８ 　 瓷研钵 。 ５ ． ９ 　 搪瓷量杯 ： １０００ｍＬ 。 ５ ． １０ 　 磨口三角瓶 ： １０００ｍＬ 。 ５ ． １１ 　 培养皿 ：  ９０ｍｍ 。 ５ ． １２ 　 容量瓶 ： １０００ｍＬ 。 ５ ． １３ 　 刻度吸管 ： １ｍＬ 。 ５ ． １４ 　 刻度吸管 ： ５ｍＬ 。 ５ ． １５ 　 三角瓶 ： ５００ｍＬ 。 ５ ． １６ 　 量筒 ： ５００ｍＬ 。 ５ ． １７ 　 量筒 ： ２５ｍＬ 。 ６ 　 试验前的准备 ６ ． １ 　 培养基的制备 称取约 ２００ｇ 的马铃薯于铝锅中 ， 加水约 １０００ｍＬ 于电炉上加热 ， 煮沸 １０ｍｉｎ 并不断搅拌 ， 趁热 用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中 ， 收集到约 ９００ｍＬ 滤液 ， 滤液搅匀待用 。 于上述滤液中加入 ２０．０ｇ 琼脂和 ２０．０ｇ 葡萄糖 ， 并放在电炉上加热 ， 不断地搅拌 ， 待琼脂完全溶化 后 ， 趁热用四层医用脱脂纱布过滤 ， 待滤液不再滴出时 ， 用水补充至 １０００ｍＬ ， 并用乳酸调节 ｐＨ 至 ４．０±０．１ ， 并分装在 ５００ｍＬ 三角瓶中 ， 每瓶分装量不超过其总量的三分之二 ， 塞上棉塞再用牛皮纸把 瓶口包好 ， 用蒸汽压力灭菌器于 （ １２１±１ ） ℃ 灭菌 １５ｍｉｎ 。 ６ ． ２ 　 无菌稀释水的制备 ６ ． ２ ． １ 　 生理盐水的配制 ： 称取 ８．５ｇ 氯化钠 ， 溶解在 １０００ｍＬ 水中 ， 混匀 。 ６ ． ２ ． ２ 　 将生理盐水分装在 １００ｍＬ 磨口三角瓶中 ， 每瓶 ４５ｍＬ ， 每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸 片 ， 塞紧瓶塞 ， 每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染 ， 用蒸汽压力灭菌器于 （ １２１±１ ） ℃ 灭菌 １５ｍｉｎ 。 ６ ． ３ 　 刻度吸管的灭菌 ６ ． ３ ． １ 　 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉 ， 棉花量要适宜 ， 长度大约 １０ｍｍ ～ １５ｍｍ ， 棉花量 不宜露在口外 ， 多余的棉花可以用火焰烧掉 。 ６ ． ３ ． ２ 　 每支刻度吸管用 １ 条约 ４０ｍｍ ～ ５０ｍｍ 宽的牛皮纸条 ， 以 ４５° 左右角度螺旋形卷起来 ， 吸管的 尖端在头部 ， 粗端将多余的纸条折叠打结 ， 不使散开 ， 标上量度 ， 若干支扎成一束 ， 置电热干燥箱中于 １６０℃±２℃ 灭菌 ２ｈ 。 ６ ． ４ 　 培养皿的灭菌 将洗净并烘干后的培养皿 １０ 个左右叠在一起 ， 用牛皮纸卷成一筒 ， 置电热干燥箱中于 （ １６０±２ ） ℃ 灭菌 ２ｈ 。 ６ ． ５ 　 石英砂的灭菌 将洗净并烘干后的石英砂装入磨口三角瓶中 ， 按 “ 无菌稀释水的制备 ” 中三角瓶包扎及灭菌步骤进 行包扎 ， 灭菌 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １４６４３ ． ３ — ２００９ ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 样品的采集 ７ ． １ ． １ 　 采集黏泥的装置见图 １ 。 　　 １ ——— 转子流量计 ； ２ ——— 浮游生物网 ； ３ ——— Ｊ１１Ｘ１０ 截止阀 ； ４ ——— Ｘ４３Ｗ１０ 旋塞阀 ； ５ ——— 量筒 。 图 １ 　 采集黏泥装置图 ７ ． １ ． ２ 　 调节采样装置中的阀门 ， 使冷却水的流速控制在 ０．８ｍ ／ ｓ 左右 ， 水流量在 １ｍ ３ ／ ｈ 左右 ， 然后关 上浮游生物网的旋塞阀 ， 过滤 １ｍ ３ 水 。 ７ ． １ ． ３ 　 关闭水阀 ， 取下浮游生物网 ， 打开旋塞阀 ， 将黏泥收集在一个 ５００ｍＬ 量筒内 ， 沉淀 ３０ｍｉｎ 后倾 出上层清液 。 将剩余浊液转至 ２５ｍＬ 量筒内 ， 静置 ３０ｍｉｎ ， 记录沉淀出的黏泥体积 。 黏泥量以 犞 计 ， 单位为毫升每立方米 （ ｍＬ ／ ｍ ３ ）， 按式 （ １ ） 计算 ： 犞 ＝ 犞 ２ 犞 １ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犞 ２ ——— 量筒中黏泥体积的数值 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犞 １ ——— 通过浮游生物网过滤的循环水量的体积的数值 ， 单位为立方米 （ ｍ ３ ）。 ７ ． １ ． ４ 　 用无菌吸管移去 ２５ｍＬ 量筒内的上清液 ， 将量筒内的黏泥或部分黏泥转移至洗净并烘干后的 瓷研钵中 ， 加入约 ２ｇ 灭过菌的石英砂 ， 充分研磨后转移至 １０００ｍＬ 洗净并烘干后的容量瓶中 ， 用无菌 稀释水稀释至刻度 ， 充分混匀 ， 并立即进行测定 。 ７ ． ２ 　 无菌箱 （ 室 ） 灭菌 把试验所用的无菌稀释水 、 无菌培养皿 、 无菌吸管等用品放入无菌箱 （ 室 ） 内 ， 打开紫外线灯灭菌 ３０ｍｉｎ 。 ７ ． ３ 　 水样的稀释和接种