ICS11.080 C50 中华人民共和国国家标准 GB/T33420—2016 压力蒸汽灭菌生物指示物检验方法 Evaluationstandardofbiologicalformoistheatsterilizationprocesses 2016-12-30发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会提出并归口。 本标准起草单位:中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、中国人民解放军疾病预防控 制所、山东新华医疗器械股份有限公司、中国医学科学院协和医院、山东利尔康消毒科技股份有限公司、 3M中国有限公司、杭州鲁沃夫货物进出口有限公司。 本标准主要起草人:张流波、张剑、姚楚水、张青、王妍彦、沈瑾、黄靖雄、朱晓明、朱汉泉、史绍毅、 马玲、班海群。 ⅠGB/T33420—2016 压力蒸汽灭菌生物指示物检验方法 1 范围 本标准规定了压力蒸汽灭菌生物指示物的检验方法。 本标准适用于压力蒸汽灭菌生物指示物的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB18281.1 医疗保健产品灭菌 生物指示物 第1部分:通则 GB/T24628 医疗保健产品灭菌 生物与化学指示物 测试设备 消毒技术规范(2002年版)卫生部 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 生物指示物 biologicalindicator;BI 对指定条件下的特定灭菌程序具有一定抗力,并装在内层包装中可供使用的染菌载体。 3.2 载体 carrier 试验微生物的支持物。 3.3 存活时间 survivaltime;ST 在规定的条件下暴露于杀菌因子,试验的生物指示物中微生物存活的最长时间。 3.4 杀灭时间 killingtime;KT 测定生物指示物抗力时,受试样本经杀菌因子作用后,全部无菌生长的最短作用时间。 3.5 D值 Dvalue 在设定的暴露条件下,杀灭特定试验微生物总数的90%所需的时间。 3.6 存活曲线 survivorcurve 在固定的灭菌因子作用下,微生物的存活情况与暴露变化的关联曲线。 3.7 生物指示物抗力测试仪 biologicalindicatorevaluatorresistometer 产生限定条件下灭菌过程中物理化学变化规定组合,以测量抗力的专用设备。 1GB/T33420—2016 4 检验指标与方法 4.1 抗力 4.1.1 菌种 用于制作压力蒸汽灭菌生物指示物的菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢(Geobacillusstearothermophilus ATCC7953或SSIK31)或被证明具有本标准所要求的同等性能的微生物。 4.1.2 菌量 回收菌量大于等于1×105CFU/片或大于等于1×105CFU/支,对于成品的指示物,载体回收的菌 量与说明书上的菌量误差在-50%~+300%之间,悬液回收的菌量与说明书上的菌量误差在±35%。 测定菌量时,应最少测试4个样本,具体检测方法参见附录A。 4.1.3 D值 测试抗力时应使用生物指示物抗力测试仪,生物指示物抗力测试仪要求见GB/T24628。在121℃ 时,D值的要求:D值大于或等于1.5min,对于成品的指示物,测试的D值应在说明书上的D值 ±20%的范围内。应至少使用下列2种方法进行测试: a) 存活曲线法测试D值,参见附录B; b)部分阴性法测试D值,参见附录C; c)验证法测试D值,将a)或者b)测试出的D值和4.1.2的回收菌量的平均数带入式(1)和 式(2),计算出ST值和KT值。参照附录D进行验证: ST≥(logN0-2)×D值…………………………(1) KT≤(logN0+4)×D值…………………………(2) 式中: N0———每批生物指示物的回收菌量的平均数。 4.1.4 存活时间与杀灭时间 在121℃时,ST值的要求:大于或等于4.5min;KT值的要求:小于或等于24min。 4.2 载体的要求 符合GB18281.1的要求。 4.3 恢复培养基的要求 4.3.1 恢复培养基应满足下列要求: a) 使10CFU~100CFU的微生物恢复生长; b)使损伤的微生物恢复生长; c)经过压力蒸汽灭菌后不会产生抑制微生物生长的物质。 4.3.2 恢复培养基按以下方法检验: 每个样本的恢复培养基中,接种10CFU~100CFU的嗜热脂肪杆菌芽孢(ATCC7953),同时设置 阴性对照和阳性对照,培养至规定时间后观察有无嗜热脂肪杆菌芽孢生长(一般观察培养基的颜色变 化)。如果恢复培养基有菌生长,并且阴性对照无菌生长和阳性对照有菌生长,判断恢复培养液合格。 4.4 稳定性试验 取包装完好的同批次生物指示物放置于制造商建议的保存条件下,存放至标签和说明书规定的有 效期限,取出再次进行评价,生物指示物应符合4.1、4.2和4.3的要求。 2GB/T33420—2016 附 录 A (资料性附录) 活菌培养计数方法 A.1 取含有10mLTPS(0.1%胰蛋白胨的生理盐水溶液)的无菌试管,加入适量无菌玻璃珠,将计数菌 片投入试管,用电动混合器混合,到菌片被完全打碎,制成菌悬液。 A.2 将试管按需要数量分组排列于试管架上,每管加入4.5mLTPS。各组由左向右,逐管标上10-1、 10-2、10-3……等。 A.3 将菌悬液用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次,随即吸取0.5mL加至10-1管内。 A.4 将10-1管依前法用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次,混匀,再吸取出0.5mL加 入10-2管内。如此类推,直至最后一管。必要时,还可作某稀释度的1∶1或1∶4稀释。 A.5 选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为15CFU~300CFU者为宜),吸取其中混合均 匀的悬液1.0mL加于无菌平皿内。每一稀释度接种2个平皿。一般需接种2个~3个不同稀释度。 A.6 将40℃~45℃熔化的嗜热脂肪杆菌芽孢恢复培养基参见《消毒技术规范(2002年版)》,倾注于已 加入样液的平皿中,每平皿15mL~20mL。 A.7 将平皿盖好,即刻轻轻摇动混匀,平放。待琼脂凝固后,翻转平皿使底向上,置56℃±2℃恒温培 养箱内培养。 A.8 培养至72h,计数菌落数。一般以肉眼观察,必要时用放大镜检查。以每平板菌落数在30CFU~ 300CFU的稀释度为准记录结果。 A.9 根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片(染菌载体)上的平均菌落数。 A.10 菌液计数从A.3步骤开始操作。 3GB/T33420—2016 附 录 B (资料性附录) 存活曲线法测试D值 B.1 随机抽取50个样本。 B.2 根据不同的暴露温度设置10个暴露时间点,每个时间点测试5个样本,最短的暴露时间可以设定 为0s,最长的暴露时间使菌量减少到小于或等于初始菌量的0.01%。 B.3 测试之前,首先对生物指示物抗力测试仪进行预热。 B.4 按照生物指示物抗力测试仪操作说明书的流程进行操作,分别对10个暴露时间分别处理。 B.5 处理完毕,参照附录A对各组样本随机抽取3个进行活菌计数。 B.6 用所得的全部存活菌数的常用对数值,对时间(min)作图,用最小二乘法进行回归分析,确定最佳 线性曲线。回归分析时不应包括原先菌落数0.5log范围内的存活数据点。计算所得直线斜率的负倒 数值,即等于以分钟表示的指定暴露条件下的D值,同时所得线性曲线相关系数应不小于0.8。 4GB/T33420—2016 附 录 C (资料性附录) 部分阴性法计算D值 C.1 随机选取120个样本。分成6组,每组20个样本。 C.2 生物指示物抗力测试仪参数设置: a) 暴露温度设置121℃; b) 暴露时间至少为6个时间点,至少1个时间点全部有菌生长,至少2个时间点部分有菌生长, 至少2个时间点全部无菌生长。 C.3 对6组样本分别暴露。 C.4 暴露完成后将6组生物指示物在56℃±2℃温度下,按照说明书要求培养到规定时间,记录阴性 和阳性结果。当最短暴露时间点全部为阳性,最长暴露时间全部为阴性,并且中间至少2组有部分样本 阳性,试验结果有效,带入式(C.1)和式(C.2)计算D值。 C.5 LimitedSpearman-Karber法(LSKP),达到无菌生长平均时间的计算见式(C.1): UHSK=UK-d 2-d n∑i=6 i=1ri …………………………(C.1) D值的计算见式(C.2): D=UHSK log10N0+0.2507…………………………(C.2) 式中: UHSK ———达到无菌生长平均时间,单位为秒(s); UK———首次显示所有样本无菌生长的暴露时间,单位为秒(s); d ———暴露时间的固定间隔,单位为秒(s); n ———每组的样本量,单位为个; ri———每次暴露无菌样本数量,单位为个; N0———回收菌落数,单位为CFU; 0.2507———计算系数。 5GB/T33420—2016 附 录 D (资料性附录) 验证法测试D值 D.1 ST值验证 将50个试验样本放入压力蒸汽灭菌生物指示物抗力测试仪中,作用浓度为2.3mg/L±0.4mg/L, 在50℃±0.5℃时,暴露时间设定为计算出的ST值,暴露完成后,将50个生物指示物样本取出,