ICS71.040.30 G66 中华人民共和国国家标准 GB/T33412—2016 生物制品中羟基柠檬酸的测定 高效液相色谱法 Determinationofhydroxycitricacidinbiochemicalproducts— HPLCmethod 2016-12-30发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位:上海市计量测试技术研究院。 本标准主要起草人:刘刚、李兰英、丁敏、闻艳丽、徐勤、许丽。 ⅠGB/T33412—2016 生物制品中羟基柠檬酸的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了用高效液相色谱法测定保健(功能)类生物制品中羟基柠檬酸含量的方法。 本标准适用于口服液、胶囊、颗粒冲剂等生物制品中羟基柠檬酸的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样中羟基柠檬酸用水提取,经离心后,上清液经0.45μm微孔滤膜过滤,经高效液相色谱分离,紫 外检测器检测,外标法定量,测定羟基柠檬酸的含量。 4 试剂和溶液 除另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 甲醇:色谱纯。 4.2 磷酸。 4.3 体积分数0.1%磷酸水溶液:准确吸取1mL分析纯磷酸,用水稀释并定容至1000mL。 4.4 羟基柠檬酸标准品(CAS号:6205-14-7):纯度≥98%。 4.5 羟基柠檬酸标准储备液:准确称取1g(精确至0.001g)经过95℃±2℃干燥2h的羟基柠檬酸标 准品,加适量水溶解,转移至100mL容量瓶中,用水定容,摇匀。羟基柠檬酸标准储备液浓度 为10.000mg/mL。 4.6 羟基柠檬酸标准溶液:使用前,将10.000mg/mL的羟基柠檬酸标准储备液用水逐级稀释,制成浓 度为1.000mg/mL、0.500mg/mL、0.200mg/mL、0.100mg/mL、0.010mg/mL、0.001mg/mL的羟基 柠檬酸标准溶液。 5 仪器与设备 实验室常规设备及下列各项: 5.1 高效液相色谱仪:配紫外检测器。 5.2 分析天平:感量0.01g,0.001g。 5.3 高速离心机:10000g。 5.4 滤膜:0.45μm,水相。 1GB/T33412—2016 5.5 超声波清洗器。 5.6 研钵。 5.7 常用玻璃量器,A级。 6 试样的制备 6.1 固体试样 从研磨成粉末(胶囊取胶囊内容物)的混匀试样中称量1.0g试料(精确至0.01g),置于烧杯中,加 水40mL,超声波清洗器100W超声20min,冷却至室温后转移至50mL容量瓶,并加水定容。 6.2 液体试样 从试样中准确移取试料1.00mL,加水稀释并定容至10mL。 上述上清液即为试料溶液。 7 分析步骤 7.1 液相色谱参考条件 色谱柱:AtlantisT3C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),或相当者; 流动相:0.1%磷酸水溶液+甲醇,体积比(99+1); 流量:0.6mL/min; 柱温:室温; 检测波长:210nm; 进样量:10μL。 7.2 绘制标准曲线 分别吸取羟基柠檬酸系列标准溶液,用0.45μm滤膜过滤,注入高效液相色谱仪,进样10μL,进行 测定,以各标准溶液浓度峰面积为纵坐标,以标准溶液标准浓度值为横坐标,绘制标准曲线,并关联获得 标准曲线公式,标准曲线的相关系数应该不小于0.999。羟基柠檬酸标准品色谱图参见附录A中 图A.1。 7.3 样品分析 吸取试料溶液(6.2),用0.45μm滤膜过滤,注入高效液相色谱仪,在7.2相同条件下进行测定。根 据色谱峰面积,利用线性回归方程计算试料溶液中羟基柠檬酸的含量。典型样品色谱图参见图A.2。 8 结果计算 8.1 固体试样 固体试样中羟基柠檬酸的含量(质量分数)按式(1)和式(2)计算: ρ=A-a b…………………………(1) w=ρ×V mi…………………………(2) 2GB/T33412—2016 式中: ρ———从标准曲线求得试料的质量浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL); A———试料的色谱峰面积(高); a———标准曲线截距; b———标准曲线斜率; w———样品中被测组分质量分数,单位为毫克每克(mg/g); V———试料溶液定容体积,单位为毫升(mL); mi———称取试料的质量,单位为克(g)。 8.2 液体试样 液体试样中羟基柠檬酸的浓度按式(3)计算: ρi=ρ×V Vi…………………………(3) 式中: ρi———试样中被测组分质量浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL); Vi———移取试料的体积,单位为毫升(mL)。 9 方法特性 9.1 测定范围 进样10μL,在相关系数大于或等于0.999的前提下,羟基柠檬酸的线性测量浓度响应范围为 0.001mg/mL~1.000mg/mL。 9.2 回收率和精密度 参见附录B。 3GB/T33412—2016 附 录 A (资料性附录) 色谱图 羟基柠檬酸(HCA)标准品色谱图,见图A.1。 图A.1 羟基柠檬酸标准品色谱图 典型样品色谱图,见图A.2。 图A.2 典型样品色谱图 4GB/T33412—2016 附 录 B (资料性附录) 回收率和精密度 本方法中羟基柠檬酸添加回收率和精密度,见表B.1。 表B.1 生物制品中羟基柠檬酸添加回收率及精密度(n=6) 样品 添加浓度/(g/kg)平均测定浓度/(g/kg)平均回收率/% 精密度/% 口服液1 0.953 95.3 9.8 10 9.865 98.6 5.5 50 48.20 96.4 4.3 胶囊1 1.086 108.6 10.1 10 9.671 96.7 6.2 50 52.15 104.3 5.6 颗粒冲剂1 0.931 93.1 10.0 10 9.586 95.9 7.1 50 51.75 103.5 4.8 5GB/T33412—2016